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上海吉凯基因化学技术有限公司

提供疾病关键基因功能研究整体解决方案

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吉凯基因成立于2002年,是国内最大的疾病关键基因研究服务综合供应商。我们建立了国内最大的慢病毒文库,包含几乎覆盖人类所有基因的,近15万个独立克 隆;发现了数百个在特定肿瘤中发挥关键作用的候选靶标基因,并与遍及全国各地的300多家三级甲等医院中,包含11种肿瘤研究领域的2000名临床科学家保持 长期紧密的合作关系。自成立以来,我们承担并完成科技部、上海市科委各类肿瘤靶标筛选相关科研课题20多项;申请用于肿瘤诊断或治疗的发明专利60余项,其中80%为基因靶标专利,20%为技术专利。目前已经授权发明专利18项,是上海市的专利试点单位。
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教你怎么做miRNA靶基因验证(实验篇)
发布时间:2015-03-20        浏览次数:634        返回列表

 在上期我们介绍了热销科研对象miRNA的靶基因预测,现在我们来介绍一下怎么用实验方法来验证我们的预测结果。又方便又有高认可度的miRNA靶基因验证实验就是双荧光素酶报告基因实验啦。

双荧光素酶报告基因实验是通过将预测能够与miRNA结合的靶基因3’UTR序列插入载体中萤火虫荧光蛋白(firefly luciferase)的3’UTR。当我们感兴趣的miRNA和质粒中的插入序列结合后,miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制萤火虫荧光蛋白的翻译最终造成荧光值的下降。海肾素荧光蛋白(renilla luciferase)是作为内参来去除组间的转染效率差异的。

其实你也可以理解为:用荧光值来判断miRNA是否和靶基因结合

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在了解原理后我们来看一下要做一次荧光素酶报告实验需要哪些东西:


1. 细胞

许多同学固执的一定要选用目的细胞来做实验,其实我们本来就是要验证分子间的相互作用,细胞只是一个媒介或载体,选用工具细胞如293T、HEK293等即可。选择工具细胞的条件总结如下:

1)好转染、且转染效率较高

2)目的microRNA的表达水平极低或不表达

2. 质粒

首先我们需要萤火虫荧光素酶3’UTR插入目的序列的载体,通常我们管它叫野生型质粒。这里要注意哦,不一定要插入靶基因的3’UTR全长。可以只插入包括miRNA结合位点前后200bp左右的序列。有的基因3’UTR有几千到上万bp,要是你一定要插入全长的话,还能不能愉快的玩耍了?

其次我们需要萤火虫荧光素酶3’UTR插入miRNA结合位点突变的序列载体,这个短语好长啊,请各位同学看清里面的定语。通常管它叫突变型质粒。这个质粒是整个实验中至关重要的一部分。你能不能发现分子间的直接相互作用就靠它了,对它好一点哦。

当然,我们需要miRNA的过表达载体。这个不用多说了吧,没有miRNA怎么做实验呢。

最后也不能少了各种对照载体啊,包括萤火虫荧光素酶空载体,miRNA空载体还有海肾素荧光载体。

下面我们还需要……没了。就是这么任性!

随后你会发现很熟悉有木有,好像都是实验室现成的,或者能够构建的,不用再去买抗体,探针,磁珠啥的了,这样也能发现分子间直接相互作用?碉堡了!

当我们把家伙事儿都备齐了,问题又来了——怎么设计实验分组啊

关于miRNA靶基因验证的双荧光素酶报告基因实验分组,在经过这么多年这么多科学家前赴后继的SCI大潮中,已经形成了一套标准。当然是领域顶尖的大佬们定的规矩,我们来看一下人家大佬的Cell文章是怎么做的。

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Cell 138, 592–603, August 7, 2009


这篇文章采用了经典的6组法,具体的实验分组为:

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是不是很复杂,结果看不懂?不用害怕,很多组都只是对照而已,真正要看的关键数据是第四组和第六组的数据,记住这句话:第四组数据死命低,其他各组数据差不多你就赢了!就是这么简单,这么任性!

我们再来用学术语句描述一下:miRNA通过和靶基因结合后抑制靶基因的翻译,从而导致萤火虫荧光素发光值下降,当结合位点被突变后荧光值回复上升,证明miRNA确实通过结合位点调控靶基因。

对于有个性有追求的同学或者处女座的同学,还有更牛的9组法,其实就是在6组法的基础上又加上了3种对照载体的分别单独感染组,这样你的实验分组就完美了。

至此从miRNA靶基因预测到验证的一个完整实验就完成了,有木有感觉很容易呢,有志于miRNA研究的同学们好好准备一下开干吧!下期我们将会为大家介绍一些实验过程中遇到的问题。

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